Page 32 - Aditivos | Ingredientes Ed. 158

ENZIMAS filamento único, que servem como moldes. Iniciadores com sequências complementares são emparelhados ao DNA molde na presença das unidades construtoras da molé- cula de DNA, isto é, trifosfatos de desoxinucleósidos de quatro tipos e outros elementos necessários, tais como tampões e íons; a reação enzimática é realizada repetidamen- te através de ciclos de recozimento desnaturante com uma quantidade aumentada de moléculas de DNA após cada ciclo. As polimerases são enzimas estáveis a altas tempera- turas (> 90oC), permitindo que a reação seja realizada automatica- mente através de um termociclador, sem a necessidade de adicionar mais enzimas ao longo dos ciclos. O desenvolvimento da PCR tornou o processo de clonagem mais preciso e eficiente. A introdução de moléculas de DNA recombinante em células hospedeiras pode ser feita, atual- mente, através de três métodos. O primeiro é usar células competentes de E. coli. As células hospedeiras são cultivadas e tratadas com cloreto de cálcio, o que permite que as células absorvam DNA estranho a uma frequência de tipicamente 107-109 colônias por grama de DNA plasmidial superenrolado (molécula de DNA bicatenário que está retorci- da ou sofre giros sobre si mesma, de tal modo que o eixo da dupla hélice própria do DNA não segue uma curva plana, mas que forma outra hélice, uma super-hélice). Outro método envolve expor as células e moléculas de DNA a um campo elétrico (eletroporação). Este método é usado em DNA trans- formador em bactérias e células eucarióticas com frequência típica de 109-1010 colônias por grama de DNA com bactérias. O terceiro método envolve o uso de células de protoplasto, ge- radas pelo tratamento de células com polietilenoglicol ou sacarose e lisozima, permitindo que as células absorvam DNA estranho a uma frequência mais baixa de 106-107 colônias por grama de DNA plas- midial superenrolado. A frequência de transformação depende do esta- do das células e das condições de tratamento. Uma vez que um DNA recom- binante é introduzido na célula hospedeira, as células são cultivadas e colocadas em pla- cas de ágar, frequen- temente contendo produtos químicos, como antibióticos, para facilitar a sele- ção de clones recom- binantes. Colônias com o gene neces- sário podem ser ras- treadas, selecionadas ou confirmadas pelo ensaio de ativida- des enzimáticas, de- tecção de proteínas com anticorpos ou hibridização in situ com sondas deriva- das de sequências de DNA conhecidas. Uma vez que um DNA recombinan- te é introduzido na célula hospedeira e o organismo recombinante isolado, são necessárias tecnologias de fermentação ou de cultura celular para a expressão ótima do gene clonado. A compreensão do metabo- lismo do organismo recombinante ou sistema celular e as caracterís- ticas dos elementos reguladores, tais como promotores de genes e reguladores, são essenciais. Técni- cas tradicionais para o cultivo de um organismo sob ótimas condições de produção também são aplicáveis. A tecnologia de DNA recombi- nante provou ser uma ferramenta poderosa na produção eficiente de uma enzima alvo. As práticas de tecnologia evidentemente trouxe- ram méritos na redução das necessi- dades de energia e matérias-primas usadas na fabricação de enzimas, reduzindo assim os custos de pro- dução. Como resultado, enzimas usadas como biocatalizadores tor- naram-se facilmente disponíveis e isso, por sua vez, facilita a aplicação de enzimas em várias indústrias. No entanto, além do fator custo e disponibilidade, outros problemas com enzimas são encontrados. Originadas de formas vivas, as enzimas geralmente só funcionam 32 ADITIVOS | INGREDIENTES