Page 31 - Aditivos | Ingredientes Ed. 158

eficiente, um produto específico; e criar células clonadas que podem ser cultivadas. Uma vez isolado, o gene pode ser alterado ou modifi- cado por vários métodos, a fim de “sintonizar” a proteína que codifica, dando-lhe propriedades mais dese- jáveis. Alternativamente, um gene pode ser dividido aleatoriamente e recombinado para gerar uma mis- tura de genes, que contém versões realizado no DNA do genoma com informação de sequência genética parcial conhecida. Além do organismo doador, um fator elementar é o organismo hospedeiro. Um hospedeiro é o or- ganismo no qual o gene alvo pode ser replicado, transcrito e poste- riormente traduzido no produto de interesse. Na maioria dos casos, o organismo hospedeiro é escolhido mais vulgarmente utilizado é o DNA plasmídico circular de dupla hélice fechado. Geralmente, contém uma região para replicação e tipicamente alguns genes resistentes a antibió- ticos como marcadores de seleção e múltiplos locais de restrição para emenda e junção com genes alvo; pode-se também utilizar um cosmí- deo (moléculas de DNA circulares extracromossomais que combinam as vantagens de um plasmídeo com a de um bacteriófago). Um vetor de transporte possui a característica de funcionar em múltiplos hospedeiros de diferentes gêneros. Um gene alvo pode ser isolado do organismo doador por clona- gem shotgun (método usado para sequenciamento de fitas longas de DNA) ou usando primers projetados a partir de sequências conhecidas do gene alvo. Essas sequências podem ser deduzidas a partir de sequências de aminoácidos N-termi- nal (amino-terminal) ou internas da proteína correspondente. Um gene alvo pode também ser sintetizado com base no conhecimento das sequências conhecidas. A descoberta de um grupo de enzimas (endonucleases ou enzimas de restrição) que clivam ou emen- dam moléculas de DNA de hélice dupla marcou o início da tecnologia do DNA recombinante. As enzimas de restrição são ne- cessárias porque podem clivar molé- culas de DNA em locais específicos, produzindo extremidades coesivas ou extremidades cegas, dependendo do padrão de ação da enzima. As mo- léculas de DNA podem ser reunidas por uma ligase, que é capaz de ligar segmentos de genes diferentes com sequências complementares em conjunto, por exemplo, para ligar o gene alvo isolado a transportadores plasmídicos. Outra enzima importante na ma- nipulação do DNA é a polimerase, usada na amplificação de moléculas de DNA por uma reação em cadeia da polimerase (PCR). As moléculas de DNA de cadeia dupla iniciais são desnaturadas pela primeira vez pelo calor para moléculas de DNA de ENZIMAS alteradas ou mutantes do gene ori- ginal. Essa mistura de genes pode, então, ser rastreada ou selecionada para produtos alvo com as proprie- dades desejadas. A tecnologia de DNA recom- binante envolve o isolamento de um gene alvo, conectando-o a um portador, transformando-o em outro organismo e usando esse organismo para propagar o produto gênico; esse processo também é chamado de "clonagem". O organismo doador, ou seja, o organismo que fornece o gene de interesse, pode ser derivado de fontes de mamíferos, plantas ou, na maioria dos casos, de microor- ganismos. A escolha de um doador adequado depende dos requisitos específicos para a propriedade do produto gênico, podendo ser encontrado através de processo de rastreio concebido para localizar o gene de interesse ou através de pro- cesso de correspondência de DNA devido a sua fácil reprodução. Pode ser células de mamíferos, células vegetais ou um sistema de insetos. A escolha do organismo hospedeiro correto é muito importante para a expressão bem-sucedida de um gene alvo. Embora, infelizmente, não existam regras definidas a esse respeito, tem sido geralmente es- tabelecido que a expressão gênica homóloga, ou seja, genes de uma origem expressa no mesmo orga- nismo ou intimamente relacionado, é a melhor escolha. No entanto, um vasto número de expressões heterólogas obtidas na bactéria E. coli suportam a conclusão de que é um hospedeiro bastante universal. A escolha de um hospedeiro não pode ser separada da escolha de um vetor. O vetor é o transportador, ou seja, é capaz de transportar o gene alvo e replicá-lo nas células hospe- deiras correspondentes, tendo a propriedade de se integrar no cro- mossomo do hospedeiro. O vetor 31 ADITIVOS | INGREDIENTES