As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos que devido as suas características singulares têm sido usadas industrialmente como conservantes biológicos de alimentos. Podem ser divididas em quatro classes: a classe I, composta pelos lantibióticos; a classe II, composta por pequenos peptídeos termoestáveis; a classe III, representada por peptídeos termolábeis de alto peso molecular; e a classe IV, representada por grandes complexos peptídicos com carboidratos ou lipídios.
A nisina é o principal representante da classe composta pelos lantibióticos. É produzida por algumas cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis e composta por 34 resíduos de aminoácidos.
A descoberta da nisina é considerada um dos marcos mais importantes da pesquisa envolvendo bacteriocinas. Comercializada desde 1953, é utilizada até hoje na produção de diferentes alimentos em escala industrial, sendo a bacteriocina com maior uso comercial e a única reconhecida pela FDA e usada como conservante alimentício.
A nisina é um peptídeo produzido por bactérias comuns do leite. Das 40 espécies conhecidas de Lactococcus lactis subsp. lactis, 35 sintetizam essa bacteriocina. A capacidade de produzir nisina está geneticamente vinculada à capacidade de fermentar sacarose; faz parte do grupo de peptídeos produzidos ribossomicamente; pertence à classe dos lantibiótico e à subclasse Ia e é identificada pelo número de identificação internacional INS como E234.
A nisina tem atividade em várias espécies, incluindo Lactococcus, Streptococcus, Listeria e Micobacterium, assim como em células vegetativas e esporos de Bacillus e Clostridium. É naturalmente produzida em vários alimentos fermentados, especialmente em produtos lácteos, e vem sendo consumida por humanos há séculos.
Apresenta amplo espectro bactericida para bactérias Gram positivas, sendo especificamente usada pela indústria de queijos para controlar o crescimento de Clostridium spp. O efeito da nisina se dá pela interação com os fosfolipídios da membrana plasmática, promovendo a formação de poros
que ocasionam o efluxo do material intracelular. Vários estudos têm avaliado a eficácia da nisina sobre patógenos e seu uso em diferentes produtos alimentícios tem sido relatado, como por exemplo, na inibição do crescimento microbiano em queijos, sucos de frutas, carne moída, salsichas, produtos enlatados, derivados do leite e cerveja.
A nisina é formada por oito alaninas, quatro ácidos aminobutíricos, três glicinas, três isoleucinas, três lisinas, duas leucinas, duas histidinas, duas metioninas, uma serina, uma valina, uma prolina, uma asparagina e os aminoácidos incomuns, duas deidroalanina e uma dedrobutirina.
A molécula de nisina, na sua forma ainda inativa, contém 57 aminoácidos, todos comuns, sendo 23 resíduos na região-líder e os 34 resíduos na região estrutural. Por meio de modificações enzimáticas, a região líder é removida e a serina e a treonina da região estrutural sofrem desidratação, resultando na formação de deidroalanina e dedrobutirina, respectivamente. Subsequentemente, pontes tioéter são formadas pela condensação da deidroalanina e dedrobutirina com cisteína, produzindo os aminoácidos lantionina e metil-lantionina, respectivamente. Nessa forma, tem-se a nisina ativa.
A solubilidade, estabilidade e atividade biológica da nisina são altamente dependentes do pH, da temperatura e da natureza do substrato. As bacteriocinas também são altamente sensíveis às enzimas proteolíticas. No entanto, a nisina apresenta estabilidade a tratamentos térmicos, tratamentos de alta pressão e exposição a ambientes ácidos. A solubilidade é influenciada pelo aumento da concentração de fosfato e pela presença de proteína. É pouco solúvel em meio aquoso neutro a moderadamente alcalino.
Os aminoácidos insaturados deidroalanina e dedrobutirina são susceptíveis ao ataque de nucleófilos (grupos hidroxil ou R nucleofílicos) presentes em pH alto. Tal fato explica a instabilidade e a solubilidade diminuídas em condições básicas; a nisina é insolúvel em solventes apolares.
Sua solubilidade em meio aquoso é altamente dependente do pH. À medida que o pH aumenta, a solubilidade diminui. Em pH 2,5 a solubilidade da nisina é de 12%, decrescendo para 4% em pH 5,0 e praticamente insolúvel em pH neutro ou alcalino.
Uma das principais propriedades da nisina é sua estabilidade ao calor, suportando autoclavagem (121°/15 minutos) em pH 2,5, sem sofrer perda de atividade. Em pH 5, porém, perde 40% de atividade e em pH acima de 6,8 a perda é de 90%. Sua estabilidade ao calor em baixo pH é atribuída, em parte, às suas cinco pontes de enxofre, que lhe conferem uma estrutura tridimensional rígida, apesar de não apresentar uma estrutura secundária. A maioria das bacteriocinas tem melhor estabilidade de sua atividade em pH de ácido a neutro, sendo praticamente inativadas em pH 8,0, a exemplo da nisina.
A inativação da nisina em meio alcalino é consequência da desnaturação, modificação química ou uma combinação de ambos.
A nisina aumenta a permeabilidade da membrana pela formação de poros, ocasionando o efluxo do material intracelular. Assim, após o tratamento com nisina, as células ficam sem energia suficiente para realizar processos biossintéticos em que a membrana plasmática, transdutora de energia, pode ser o alvo primário na atuação da nisina. Sendo a bacteriocina carregada positivamente com partes hidrofóbicas, ocorrem interações eletrostáticas com o grupamento fosfato da membrana celular, carregado negativamente, promovendo o início da ligação da bacteriocina com a célula-alvo.
A nisina possui a habilidade de inibir o crescimento microbiano de bactérias Gram positivas em alimentos, inclusive as patogênicas de alto risco, como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Streptococcus faecalis, Clostridium botulinum e Listeria monocytogenes.
A ação da nisina sobre células de bactérias Gram positivas ocorre em duas etapas. A primeira envolve a adsorção não específica da nisina sobre a parede celular, dependente do pH, que ocorre em valor mínimo de 3,0 e máximo de 6,5. Envolve, ainda, a composição fosfolipídica da membrana citoplasmática dos microorganismos sensíveis; a presença de cátions divalentes e trivalentes; e a concentração utilizada. A nisina permanece sensível as proteases e o tratamento com enzimas proteolíticas protege as células susceptíveis a ação da nisina contra seu efeito letal.
Na segunda etapa, a nisina se torna insensível as proteases e as células sofrem mudanças irreversíveis. É fortemente atraída pelos fosfolipídios e lisossomos na membrana das bactérias, formando poros ou canais de 0,2 a 1,0 nm de diâmetro. A despolarização simultânea da membrana causa um efluxo rápido de componentes essenciais, como íons K+, aminoácidos e ATP, levando a uma série de alterações que termina com a lise celular.
O estado fisiológico da cultura tem grande influência na susceptibilidade à ação das bacteriocinas, sendo as células metabolicamente ativas mais sensíveis. A inibição da célula persiste enquanto houver bacteriocina ativa remanescente no meio de crescimento. O mecanismo pelo qual a nisina impede a germinação de esporos é diferente do das células vegetativas. Os grupos reativos deidroalanina e dedrobutirina da nisina interajam com grupos sulfidril vitais presentes na membrana dos esporos recém germinados e exercem profundo efeito bacteriostático, resultando na inibição subsequente do esporo. Assim, a nisina permite a germinação do esporo, mas inibe as etapas posteriores do processo de formação de novas células.
Além de demonstrar atividade sobre bactérias Gram positivas, especialmente na forma de esporos, a nisina também se mostra efetiva sobre bactérias Gram negativas e fungos, quando usada em combinação com outro composto, como um agente quelante.
Nas bactérias Gram negativas, a presença da camada de lipopolissacarídeos oferece maior proteção à célula, não permitindo que agentes externos alcancem a membrana citoplasmática.
A camada de lipopolissacarídeos é formada por compostos que possuem caráter aniônico, gerando uma superfície hidrofílica. Desse modo, a membrana externa repulsa substâncias hidrofóbicas e macromoléculas, como a nisina. No entanto, pelo caráter aniônico da camada de lipopolissacarídeos, esta pode se ligar à molécula da nisina, que tem caráter catiônico, formando uma estrutura estável por interações eletrostáticos, mas, mesmo assim, a nisina não consegue alcançar a membrana citoplasmática da célula. A nisina é efetiva sobre bactérias Gram negativas quando combinada com ácido láctico.
A nisina foi reconhecida como aditivo alimentar pela Organização de Alimentos e Agricultura/Organização Mundial de Saúde (FAO/OMS) em 1969, com o limite máximo de ingestão de 33.000 Unidades Internacionais/kg de peso corpóreo. Em 1988, a FDA concedeu-lhe o status de GRAS (Generally Recognized as Safe).
Diversos países permitem o uso de nisina em produtos como leite, queijo, produtos lácteos, tomates e outros vegetais enlatados, sopas enlatadas, maionese e alimentos infantis.
No Brasil, a nisina é aprovada para uso em todos os tipos de queijo no limite máximo de 12,5 mg/kg e em produtos cárneos, sendo permitida sua utilização na superfície externa de salsichas de diferentes tipos. O produto pode ser aplicado como solução de ácido fosfórico grau alimentício.
Atualmente, seu uso é aprovado em alimentos em mais de 50 países.
Márcia Fani
Editora
