As enzimas microbianas desempenham papel significativo em diferentes processos alimentícios, sendo, em geral, utilizadas para três finalidades: como aditivo, como ingrediente e para favorecimento de processos relacionados a laticínios, carnes, panificação, bebidas fermentadas e sucos.

Enzimas microbianas

O uso de enzimas ou microrganismos na preparação de alimentos é um processo antigo. Com o avanço da tecnologia, novas enzimas com ampla gama de aplicações e especificidade foram desenvolvidas e novas áreas de aplicação ainda estão sendo exploradas.

O desenvolvimento de processos de fermentação durante a última parte do século passado, visando especificamente a produção de enzimas por meio de cepas de produção selecionadas, tornou possível a fabricação de enzimas com preparações purificadas e bem caracterizadas, inclusive em larga escala. Esse desenvolvimento permitiu a introdução de enzimas nos mais variados processos industriais.

As enzimas são catalisadores biológicos usados para facilitar e acelerar reações metabólicas em organismos vivos. São proteínas e requerem um substrato específico para sua atividade. As suas condições de catalisação estão dentro de limites estreitos e temperatura ótima, condições de pH e concentração de oxigênio. A maioria das enzimas é desnaturada a temperaturas acima de 42ºC. No entanto, algumas enzimas bacterianas são tolerantes a um intervalo de temperatura mais amplo.

Várias cepas de microrganismos foram selecionadas ou geneticamente modificadas para ampliar a eficiência com a qual se produzem enzimas. Na maioria dos casos, os genes modificados são de origem microbiana, embora também possam ser de diferentes reinos.

A produção industrial de enzimas por microrganismos envolve o cultivo de microrganismos em enormes tanques, onde as enzimas são secretadas no meio fermentativo como metabólitos da atividade microbiana. As enzimas assim produzidas são extraídas, purificadas e utilizadas como auxiliares de processamento na indústria alimentícia e para várias outras aplicações. As enzimas purificadas são isentas de células e não contêm outras macromoléculas, como o DNA.

As enzimas microbianas desempenham papel importante nas indústrias de alimentos porque são mais estáveis do que as enzimas vegetais e animais. Podem ser produzidas por meio de técnicas de fermentação de maneira econômica e com menor necessidade de tempo e espaço e devido a sua alta consistência, a modificação e otimização do processo podem ser feitos com muita facilidade.

Muitas dessas enzimas encontram inúmeras aplicações em vários setores industriais. Nos alimentos, as enzimas podem modificar e melhorar as propriedades funcionais, nutricionais e sensoriais de ingredientes e produtos e, portanto, encontram ampla aplicação no processamento e produção de todos os tipos de produtos alimentícios.

Uma de suas principais vantagens, é que as enzimas são usadas como alternativa à tecnologia tradicional baseada em produtos químicos, podendo substituir substâncias químicas sintéticas em uma ampla gama de processos, o que oferece vantagens no desempenho ambiental dos processos, diminuindo os níveis de consumo de energia e a biodegradabilidade dos produtos. Além disso, como as enzimas são mais específicas em sua ação do que os reagentes químicos, os processos catalisados por enzimas apresentam menos reações colaterais e subprodutos (produtos residuais), resultando em produtos de maior qualidade e menos poluição. As enzimas também podem catalisar reações sob condições muito suaves, permitindo condições de processamento que não destroem atributos valiosos dos alimentos e dos seus componentes.

Principais enzimas alimentícias de origem microbiana

A indústria alimentícia utiliza mais de 55 produtos enzimáticos diferentes no processamento de alimentos. Enquanto lactase, lipase, protease, transglutaminase, asparaginase e pectinase são amplamente empregadas para remover a lactose, amadurecer o queijo, amaciar a carne, minimizar a formação e a clarificação da acrilamida, outras enzimas como fitase, lacase, complexo de xilanase e celulase estão ganhando importância em várias tecnologias de processamento de alimentos para melhorar a biodisponibilidade de minerais, minimizar odores, estabilizar bebidas e na produção de nutracêuticos.

α -amilase. São enzimas que degradam o amido, capazes de hidrolisar ligações α-1,4 glicosídicas de polissacarídeos, o que resulta na produção de dextrinas de cadeia curta. A maioria das α-amilases são metaloenzimas e requerem íons de cálcio para sua atividade, estabilidade e integridade.

As amplas aplicações das α-amilases na indústria alimentícia incluem panificação, fabricação de cerveja, liquefação de amido, bem como auxiliares digestivos. São amplamente utilizadas na indústria de panificação como intensificadores de sabor e agentes anti-incrustantes para melhorar a qualidade do pão. Durante o cozimento, as α-amilases são adicionadas à massa para a conversão do amido em dextrinas menores, que são posteriormente fermentadas. Melhoram o sabor, a cor da crosta e as qualidades de tostagem do pão.

As α-amilases também são utilizadas na fabricação de dextrinas ramificadas de alta massa molecular. São usadas como agente de glaceamento para a produção de bolos de arroz e alimentos em pó. Também encontram aplicação na liquefação do amido, convertendo-o em xaropes de glicose e frutose. A conversão enzimática do amido envolve três etapas: gelatinização, liquefação e sacarificação. A gelatinização envolve a formação de uma suspensão viscosa por dissolução de grânulos de amido, seguido por um processo de liquefação, que reduz a viscosidade e envolve hidrólise parcial. A glicose e a maltose são posteriormente produzidas por sacarificação, processo que requer enzimas altamente termoestáveis. A maior parte da sacarificação do amido é realizada com α-amilases de Bacillus amyloliquefaciencs, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus licheniformis.

Outras aplicações das α-amilases incluem a clarificação de sucos de frutas, que é realizada na presença de celulases e pectinases para melhorar o rendimento e tornar o processo econômico.

Glucoamilases. Também chamadas de enzimas sacarificantes, são enzimas exo-atuantes que catalisam a hidrólise do polissacarídeo da extremidade não redutora, liberando β-glicose. São produzidas principalmente por Aspergillus niger e Aspergillus awamori, sendo a produzida por Rhizopus oryzae amplamente utilizada para aplicações industriais.

A maioria das glucoamilases são estáveis em baixas temperaturas, perdendo atividade em temperaturas mais altas, devido a mudança conformacional.

Encontram ampla gama de aplicações na indústria de alimentos, como por exemplo, para a produção de xaropes com alto teor de glicose e de frutose.

Na indústria de panificação melhoram a qualidade da farinha, reduzem o endurecimento da massa, bem como melhoram a cor da crosta do pão e a qualidade de produtos de panificação com alto teor de fibra. As glucoamilases convertem o amido presente na farinha em maltose e açúcares fermentáveis, levando ao crescimento da massa.

As glucoamilases desempenham papel importante na produção de saquê e molho de soja, bem como na produção de cerveja light. Metabolizam as dextrinas e as convertem em açúcares fermentáveis com valor calórico e teor alcoólico reduzidos na cerveja.

Proteases. Representam 60% das enzimas industriais do mercado. São enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas presentes em proteínas e polipeptídeos. Podem ser classificadas com base em sua origem, atividade catalítica e natureza do grupo reativo no sítio catalítico. As principais fontes de enzimas proteases são animais, plantas e microrganismos (bacterianos e fúngicos).

As proteases são divididas em dois grupos: exopeptidases e endopeptidases, com base no local de ação nas cadeias polipeptídicas. As exopeptidases agem nas extremidades das cadeias polipeptídicas e as endopeptidases agem aleatoriamente nas regiões internas das cadeias polipeptídicas. As endopeptidases são ainda classificadas em seis grupos, com base no resíduo catalítico presente no sítio ativo: serina, aspártico, cisteína, metalo, ácido glutâmico e protease treonina. As proteases vegetais, como a bromelaína, ficina e papaína, são amplamente utilizadas na indústria de alimentos para várias aplicações, como cerveja, amaciamento de carne, coagulação do leite e como auxiliar digestivo. Além disso, as proteases também são utilizadas para melhorar o sabor, valor nutricional, solubilidade e digestibilidade das proteínas dos alimentos, bem como para modificar suas propriedades funcionais, incluindo coagulação e emulsificação.

As proteases são amplamente utilizadas na indústria de panificação para a produção de pão, assados, biscoitos e waffles. Essas enzimas são utilizadas para reduzir o tempo de mistura, diminuir a consistência e uniformidade da massa, regular a força do glúten no pão e melhorar a textura e o sabor.

A protease ácida de Aspergillus usamii tem sido empregada com sucesso para a melhoria das propriedades funcionais do glúten de trigo. A adição de protease pode liberar peptídeos e níveis de aminoácidos suficientes no mosto para obter uma fermentação adequada. As proteases fúngicas ácidas são usadas para melhorar a fermentação da cerveja, pois são eficientes mesmo em pH baixo, equilibrando o perfil de aminoácidos.

Outra aplicação importante das proteases está associada à indústria de laticínios. As proteases de ocorrência natural contribuem significativamente para as características de sabor do queijo. São utilizados para acelerar o amadurecimento, modificar as propriedades funcionais e reduzir as propriedades alergênicas dos produtos lácteos. Na fabricação de queijo, também são usadas para hidrolisar a ligação peptídica específica para gerar paracaseína e macropeptídeos.

Lactase (β-galactosidase). A hidrólise da lactose é um importante processo biotecnológico na indústria de alimentos; a enzima β-galactosidase catalisa a hidrólise da lactose.

Pertence à família das hidrolases, a β-galactosidase pode ser obtida de vários sistemas biológicos, incluindo plantas, animais e microrganismos. Sua produção a partir de microrganismos, como bactérias, fungos e leveduras, é uma escolha preferida devido ao maior rendimento e, portanto, ao custo relativamente baixo da enzima, sendo a escolha da fonte dependente da aplicação final da enzima. A β-galactosidase de leveduras com pH ótimo de 6,5 a 7,0 é geralmente usada para a hidrólise da lactose no leite de soro de leite. No caso da hidrólise ácida do soro de leite, a β-galactosidase fúngica com pH ótimo de 3,0 a 5,0 é adequada.

Em aplicações industriais, duas classes principais de β-galactosidase são de importância primordial: a β-galactosidase termoestável e a β-galactosidase ativa a frio.

Em escala comercial, a β-galactosidase é produzida a partir de microrganismos com status GRAS para aplicação em leite e laticínios. A lactase é usada com leite e produtos à base de leite para reduzir a intolerância à lactose. A vantagem adicional da hidrólise da lactose em monômeros é a redução da necessidade de adoçantes, pois podem melhorar a doçura dos produtos. Outra aplicação importante da lactase é a hidrólise da lactose no soro de leite, um subproduto da produção de queijo e seus principais componentes são lactose, proteínas e minerais. Outra aplicação da lactase é a formação de galactooligossacarídeos (GOS) a partir da hidrólise da lactose devido à atividade de transglicosilação da β-galactosidase. O GOS pode ser usado como ingrediente alimentar prebiótico.

Lipases. São enzimas que catalisam a hidrólise de triglicerídeos de cadeia longa. As lipases microbianas são produzidas por bactérias, fungos e leveduras. Na indústria de alimentos e bebidas, as lipases encontram grande aplicação nas indústrias de laticínios, panificação, suco de frutas, cerveja e vinho.

As lipases comerciais são usadas principalmente para o desenvolvimento de sabor em produtos lácteos e processamento de outros alimentos que contêm gordura. Podem melhorar o sabor característico do queijo, agindo sobre as gorduras do leite para produzir ácidos graxos livres após a hidrólise. Diferentes tipos de queijo podem ser produzidos usando lipases de várias fontes, como por exemplo, queijo romano com lipase pré-gástrica de cabrito/cordeiro, queijo Camembert com lipase de Penicillium camemberti e queijo cheddar com Aspergillus niger ou A. oryzae. A catálise da lipase pode melhorar a textura e maciez do queijo.

As lipases também são usadas como agentes de desenvolvimento de sabor em manteiga e margarina, bem como para prolongar a vida útil de vários produtos de panificação. Em bebidas alcoólicas, como o vinho, o aroma pode ser modificado usando lipase.

As lipases também encontram aplicação como biossensores na indústria de alimentos. A lipase imobilizada foi usada com sucesso para a determinação de pesticidas organofosforados com um sensor de impedância de onda acústica de superfície por hidrólise da lipase. Também pode ser usada na determinação de triglicerídeos e colesterol no sangue, se a lipase for imobilizada em eletrodos de pH/oxigênio em combinação com glicose oxidase.

As lipases microbianas, como a lipase de Candida rugosa, possui muitas aplicações que não podem ser atendidas por síntese química. Essa lipase encontra aplicação na produção de sorvete, proteína unicelular, ésteres de carboidratos e derivados de aminoácidos.

Além disso, a lipase também pode ser usada no processamento de diferentes fluxos de resíduos que são liberados pelas indústrias de alimentos.

Fosfolipases. Decompõem seletivamente os fosfolipídios em ácidos graxos e outras substâncias lipofílicas. Podem ser divididas em quatro classes principais (A, B, C e D) com base em seu mecanismo de ação. A fosfolipase A1 (PLA1), a fosfolipase A2 (PLA2) e a fosfolipase B atuam nas ligações éster carboxílico dos fosfolipídios, deslocando e substituindo a cadeia do grupo acila por meio de várias reações químicas, como hidrólise, esterificação e transesterificação. As fosfolipases C (PLC) e D (PLD), que modificam o grupo de cabeças polares, também são conhecidas como fosfodiesterases e reconhecem a ligação fosfodiéster.

As fosfolipases são amplamente utilizadas na indústria de alimentos, principalmente na produção de óleos (degomagem de óleos vegetais), na indústria de laticínios (fabricação de queijos) e na fabricação de diversos itens de panificação (fabricação de pão). Também são usadas no processamento de vários produtos lácteos para aumentar a estabilidade da gordura ou maximizar a produção de queijo, leite, manteiga e sorvete. As aplicações importantes das fosfolipases incluem o aumento do sabor do queijo e a produção de gordura do leite lipolisado para uso na manteiga como sabor.

Estearases. Em solução aquosa, as esterases são capazes de facilitar a divisão dos ésteres em ácido e álcool. Além disso, as esterases hidrolisam acilgliceróis de cadeia curta, ao invés de acilgliceróis de cadeia longa, sendo, portanto, diferentes das lipases. As esterases desempenham papel de destaque na indústria de alimentos e bebidas alcoólicas, onde têm sido utilizadas principalmente para a modificação de óleo e gordura em vários sucos de frutas e para a produção de aromas e sabores.

As feruloil esterases, um importante grupo de enzimas da família das esterases, quebram a ligação éster entre o ácido ferúlico e diferentes polissacarídeos na parede celular da planta. Uma vez que as feruloil esterases hidrolisam a biomassa lignocelulósica, são inevitáveis para o gerenciamento de resíduos. Esta esterase, em particular, tem grande aplicação comercial devido ao seu alto pH, estabilidade térmica e resistência à protease. Na fabricação de queijo, os sabores frutados são o resultado de diferentes ésteres metílicos ou etílicos de ácidos graxos de cadeia curta.

A feruloil esterase é uma enzima chave na biossíntese do ácido ferúlico, que é o precursor da vanilina, um composto aromático usado em alimentos e bebidas.

Lipoxigenases. Estão envolvidas na dioxigenação de ácidos graxos poliinsaturados em lipídios contendo cis-1,4-pentadieno. Contêm uma única cadeia polipeptídica que é posteriormente montada em um domínio N-terminal e o domínio catalítico β-barrel.

As enzimas lipoxigenases não contêm ferro heme. A reação catalisada por lipoxigenase produz diferentes precursores para a produção de diferentes substâncias químicas voláteis e produtoras de aroma em plantas. São usadas na geração de aroma na indústria de alimentos e também na fabricação de pão. As lipoxigenases bacterianas possuem especificidade diferente em relação aos ácidos graxos.

Suas principais aplicações são em massas, tendo a capacidade de branquear o carotenóide do pigmento da farinha, por co-oxidação do pigmento com ácidos graxos. As lipoxigenases também são empregadas para melhorar a tolerância a mistura e diferentes propriedades de manuseio da massa. Esse efeito é devido a oxidação do grupo tiol no glúten, que pode levar à redistribuição de diferentes ligações dissulfeto, reticulação da tirosina e posterior fortalecimento do glúten. Isso também leva à melhoria na reologia da massa.

Celulases. São enzimas que atuam na celulose polimérica e hidrolisam as ligações β-1,4 para liberar unidades de glicose. As três classes principais de celulases são endo- (1,4) -β-d-glucanase, exo- (1,4) -β-d-glucanase e β-glucosidases. Os módulos catalíticos das celulases pertencem à família da glicosido hidrolase (GH) e foram classificados em diferentes grupos com base nas diferenças nas sequências de aminoácidos e nas características estruturais tridimensionais.

As enzimas da família glicosido hidrolase usam principalmente o mecanismo de catálise ácido-base para clivar as ligações glicosídicas na celulose. A catálise é realizada por dois resíduos principais (um doador de prótons e um nucleófilo) da enzima na região do sítio ativo. A hidrólise ocorre via mecanismo de retenção ou inversão, dependendo da posição espacial desses resíduos catalíticos na enzima.

As endoglucanases clivam as ligações β-1,4 na região amorfa da celulose e expõem as extremidades não redutoras e redutoras do polímero celulósico. A maioria das endoglucanases fúngicas contém um módulo catalítico com módulo de ligação a carboidratos (CBM), mas o módulo catalítico sem CBM também foi relatado em espécies de fungos. Múltiplos módulos catalíticos e CBMs estão presentes em endoglucanases bacterianas.

As exoglucanases ou celobiohidrolases (CBHs) atuam nas extremidades redutoras ou não redutoras disponíveis do polímero de celulose e liberam a celobiose. Exoglucanases ou celobiohidrolases fúngicos e bacterianos apresentam diversidade no módulo catalítico e pertencem às famílias de glicosídeos hidrolases. As β-glucosidases catalisam a etapa final na quebra da celulose por meio da clivagem dos resíduos β-d-glucosil terminais não redutores e da remoção da β-d-glicose.

A fabricação industrial de celulases é principalmente a partir de fontes microbianas, bactérias e fungos. As bactérias aeróbias apresentam mecanismo de degradação da celulose semelhante ao dos fungos aeróbicos. Em bactérias anaeróbicas, os celulossomas estão localizados na superfície da célula e operam por meio de um sistema diferente. Celulases de fungos (Aspergillus e Trichoderma) e bactérias (Bacillus e Paenibacillus) são potencialmente utilizadas na produção de alimentos.

Na indústria de sucos, as celulases são aplicadas em combinação com outras enzimas maceradoras para aumentar o desempenho e rendimento do processo, melhorando os métodos de extração, clarificação e estabilização dos sucos. Também podem reduzir a viscosidade do néctar e do purê de frutas, como damasco, manga, ameixa, mamão papaia, pera e pêssego, e são usados para a extração de flavonóides de flores e sementes.

As celulases são utilizadas para a extração de compostos fenólicos do bagaço da uva. As β-glucosidases em combinação com a pectinase alteram a estrutura, o sabor e o aroma das frutas e vegetais, bem como reduzem o amargor das frutas cítricas e melhoram o aroma e o sabor. São usadas com outras enzimas para a extração eficiente do azeite de oliva.

Na produção de vinho, as celulases são usadas em combinação com outras enzimas para aumentar o rendimento e a qualidade. As principais vantagens do uso dessas enzimas são a maceração melhorada, melhor desenvolvimento da cor, clarificação do mosto e, finalmente, estabilidade e qualidade do vinho. O aroma dos vinhos pode ser melhorado por β-glucosidases por meio de modificações de precursores glicosilados.

Xilanases. São produzidas por microrganismos para clivar as xilanas, um dos principais constituintes da hemicelulose. Três enzimas principais, endoxilanases, exoxilanases e β-xilosidases, agem sinergicamente e são necessárias para a quebra da estrutura do xilano na hemicelulose. As endoxilanases clivam as ligações β-1,4 da estrutura de xilano. As exoxilanases hidrolisam as ligações β-1,4 do xilano das extremidades não redutoras e liberam xilooligossacarídeos. As β-xilosidases clivam a xilobiose e os xilooligossacarídeos para liberar xilose.

As principais funções das xilanases são desempenhadas por um módulo catalítico e poucas classes possuem um módulo de ligação a carboidratos adicional para ligação aos substratos. Os dois principais módulos catalíticos das hemicelulases são glicosídeo hidrolases e carboidratos esterases. A endoxilanase hidrolisa a estrutura do xilano e possui núcleos catalíticos pertencentes às famílias 8, 10, 11, 30 e 43 do glicosídeo hidrolase, sendo os mais comuns o glicosídeo hidrolase 10 e 11. Estes diferem em suas especificidades de substrato e o glicosídeo hidrolase10 é mais ativo na xilana substituída. Semelhante às celulases, também podem conter CBMs. As exoxilanases clivam aleatoriamente a estrutura do xilano de dentro, liberando xilo-oligômeros de cadeia longa sobre os quais as β-xilosidases atuam. O módulo catalítico dessas enzimas pertence às famílias 3, 30, 39, 43, 52 e 54 do GH. Essas duas enzimas costumam ser chamadas coletivamente de xilanases. A β-xilosidase ou xilan-1,4-β-xilosidase atuam nos xilooligossacarídeos e na xilobiose para liberar xiloses.

As xilanases são produzidas por microorganismos como actinomicetos, bactérias e fungos. Os principais actinomicetos e espécies bacterianas que produzem xilanase são Streptomyces sp., Bacillus sp. e Pseudomonas sp. Os produzidos por bactérias e actinomicetos são eficazes em uma faixa mais ampla de pH (5,0 a 9,0), com temperatura ótima para a atividade da xilanase entre 35°C e 60°C. Os fungos são as principais fontes de xilanase, devido ao seu alto conteúdo e liberação extracelular da enzima. As principais espécies de fungos que produzem xilanase são Aspergillus sp., Fusarium sp. e Penicillium sp. As xilanases fúngicas têm maior atividade do que bactérias ou leveduras.

As enzimas da hidrólise de carboidratos são geralmente usadas na indústria de panificação. As propriedades reológicas da massa são melhoradas por meio da hidrólise enzimática de polissacarídeos não amiláceos. As xilanases são amplamente utilizadas na indústria de panificação com outras enzimas. A eficácia potencial das enzimas xilanolíticas aumenta seu uso na panificação. Podem aumentar o volume específico do pão e isso melhora a qualidade do pão. A hemicelulose da farinha de trigo é quebrada pela xilanase, que aumenta a ligação de água na massa. A massa fica mais macia e a formação do miolo é retardada, permitindo que a massa cresça.

A xilanase é usada para melhorar a textura, sabor e palatabilidade em biscoitos. Também desempenham papel importante na produção de suco, melhorando a extração, clarificação e estabilização. Em combinação com outras enzimas, as xilanases levam a um melhor rendimento de suco e maior recuperação de aromas, óleos essenciais, vitaminas, sais minerais, pigmentos, etc. Nas indústrias de fabricação de cerveja, as xilanases são usadas para hidrolisar a parede celular da cevada. A hidrólise leva à liberação de arabinoxilanos e oligossacarídeos inferiores, o que reduz a aparência turva e a viscosidade da cerveja.

Pectinases. São enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas em polímeros pécticos. Substâncias pécticas encontradas no tomate, abacaxi, laranja, maçã, polpa de limão, casca de laranja e outras frutas cítricas atuam como substrato natural para esta enzima. Funcionalmente, as pectinases podem ser categorizadas como poligalacturonases, que hidrolisam as ligações glicosídicas α- (1-4); pectina esterases, que removem os grupos acetil e metoxil da pectina;, pectina liase; e pectato liase.

As pectinases podem ser produzidas a partir de microrganismos naturais e também recombinantes com tentativas feitas para aumentar sua termoestabilidade e rendimento. Com base no pH, existem pectinases ácidas e alcalinas, também agrupadas em endopectinases quando a enzima cliva aleatoriamente; e exopectinases, quando as extremidades terminais são direcionadas.

As pectinases encontram uma infinidade de aplicações industriais, sendo a sua maior área de atuação em sucos de frutas. Os sucos com pectinase adicionada têm uma aparência mais clara e capacidade de filtração do que seus homólogos com deficiência de enzima. Além de reduzir a turbidez e a geração de névoa de sucos de frutas de origem natural, as pectinases também melhoram a cor e o sabor das bebidas. A adição de gelatina e pectina aumenta muito a viscosidade e a turvação dos sucos, e a remoção da névoa é a parte mais cara da produção do suco. O uso de enzimas biogênicas como as pectinases em sucos atuaria quase nove vezes melhor do que a maceração mecânica para obter bons resultados.

Glicose oxidase. Pertence a um grande grupo de famílias de enzimas chamadas oxidorredutases. A glicose oxidase é uma flavoproteína descoberta em 1928, por Detlev Müller, professor de botânica na Universidade de Copenhague, o qual afirmou que, na presença de oxigênio dissolvido, a enzima pode converter a glicose em ácido glucônico. Na reação, a β-d-glicose é oxidada a gluconolactona e o oxigênio molecular é reduzido a peróxido de hidrogênio. A glucanolactona é, então, espontaneamente hidrolisada em ácido glucônico. A enzima é homodimérica e contém duas subunidades de cadeia polipeptídica semelhantes (80 kDa). As subunidades são covalentemente ligadas por ligações dissulfeto e uma molécula de flavina adenina dinucleotídeo (FAD) não covalentemente ligada à região do sítio ativo de cada subunidade.

A produção de glicose oxidase foi relatada por vários microrganismos e descoberta pela primeira vez em Aspergillus niger e Penicillium glaucum. A espécie Aspergillus niger é amplamente utilizada para a produção de glicose oxidase e suas cepas podem produzir maior quantidade de glicose oxidase. O Penicillium adametzii é um fungo amplamente utilizado para a produção de glicose oxidase extracelular. As diferentes espécies bacterianas também são relatadas como produtoras de glicose oxidase. Embora muitas espécies de bactérias e fungos sejam relatadas para produzir esta enzima, fungos são considerados para a produção industrial de glicose oxidase.

A glicose oxidase tem amplo uso em diversas indústrias, sendo que alimentícia aumenta o sabor, o aroma e a estabilidade dos produtos alimentícios, removendo a glicose e o oxigênio das bebidas diabéticas e da clara do ovo. Seu uso está aumentando na indústria de panificação porque seus efeitos oxidantes tornam a massa mais forte. A glicose oxidase melhora a cor, textura, sabor e vida útil dos produtos alimentícios e evita o apodrecimento. Durante a embalagem de alimentos, a glicose oxidase é usada para aumentar o tempo de armazenamento, removendo o oxigênio.

Lacases. São um agrupamento de oxidases que representam o maior subgrupo de enzimas multicobre. Comumente conhecidas como oxidases azuis, são utilizadas para estudar seu potencial de oxidação de compostos fenólicos e, portanto, aplicadas em diversos setores industriais. Essas enzimas atuam como um biocatalisador potente para aplicação em síntese química, bio-branqueamento de polpa de papel, biorremediação, biossensor, estabilização de vinhos e acabamento têxtil. Possuem especificidade diferente para substrato e uma ampla gama de substratos oxidáveis, que depende ainda do tipo de fontes microbianas que produzem a enzima. As lacases catalisam a oxidação de uma ampla gama de compostos, como fenólicos, aminas aromáticas e ascorbato. Essas enzimas combinam substrato redutor tendo quatro elétrons oxidados com quatro elétrons reduzidos para clivar a ligação de dioxigênio na presença de quatro átomos de cobre presentes nas lacases.

As lacases são secretadas extracelularmente por vários fungos como um produto do seu metabolismo secundário durante a fermentação, mas a sua produção é limitada a algumas espécies de fungos. Os produtores bem conhecidos de lacases pertencem aos Deuteromicetos, Ascomicetes e Basidiomicetos. O Funalia trogii é um fungo da podridão branco capaz de produzir lacase por fermentação absorvente; Bacillus licheniformis produz lacases recombinantes para aplicações industriais. Recentemente, expressões heterólogas têm sido usadas para a produção de lacase.

A lacase é usada para modificar a aparência da cor das indústrias de alimentos e bebidas ou para estabilizar o vinho como alternativa aos adsorventes físicos e químicos. A remoção de polifenóis do vinho evita alterações adversas nas características organolépticas, incluindo estabilidade em meio ácido e inibição reversível devido a presença de sulfito.

A formação de neblina é um dos problemas da indústria cervejeira. Para evitá-lo, lacases têm sido aplicadas para a oxidação de polifenóis como um substituto para a abordagem tradicional. Essa enzima também é usada para remoção de oxigênio na etapa final da produção de cerveja, o que prolonga o tempo de armazenamento da cerveja.

A lacase também é usada na indústria de panificação, devido a capacidade de se reticular com biopolímeros. Sua aplicação aumenta a estabilidade, resistência e diminui a viscosidade, o que aumenta ainda mais a usinabilidade da massa de pão. Além disso, aumenta o volume e a suavidade do produto.

Catalase. É uma proteína tetramérica encontrada em organismos aeróbios; ajuda a decomposição do peróxido de hidrogênio. Esta enzima pode ser produzida a partir de fontes microbianas, como Aspergillus niger e Micrococcus luteus e de fígado bovino. Os microrganismos são geralmente preferidos como fontes para a produção de enzimas devido as suas vantagens, como crescimento rápido, fácil manuseio e ajuste genético para a obtenção de um produto desejado.

A catalase é frequentemente usada com glicose oxidase para preservação de alimentos. É aplicada na indústria de processamento de leite para eliminar o peróxido do leite, para remover a glicose da clara do ovo na indústria de panificação e em embalagens de alimentos para prevenir a oxidação e controlar a perecibilidade dos alimentos. Esta enzima tem uso limitado na produção de queijo.

Peroxidases. São proteínas oxidorredutases que contêm protoporfirina IX de ferro (III) como grupo protético. Catalisam a redução de peróxidos e a oxidação de uma ampla gama de compostos orgânicos e inorgânicos. Sua massa molecular varia de 30.000 a 150.000 Da e compreendem um grupo de enzimas únicas, como iodeto peroxidase, NADH peroxidase e glutationa peroxidase, bem como um grupo de outras enzimas não específicas. Presentes em plantas, microrganismos e animais, estão envolvidos em processos de lignificação em plantas e mecanismos de defesa contra tecidos danificados ou infecciosos.

Entre os microrganismos, Phanerochaete chrysosporium é o organismo secretor de peroxidase mais bem caracterizado. As aplicações em escala industrial de peroxidases fúngicas são limitadas por desafios associados à modificação pós-tradução de proteínas. No entanto, as peroxidases bacterianas são mais fáceis de produzir e apresentam melhor estabilidade e atividade adequadas para aplicações industriais. Essas enzimas são aplicadas com lacases bacterianas para a descoloração do corante. As atividades da peroxidase são relatadas em táxons bacterianos, como Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria e Acidobacteria. Além disso, os actinomicetos, que são bactérias do solo, são capazes de crescer como fungos e ter nicho ecológico semelhante, podendo produzir peroxidases para a degradação da lignina. A primeira lignina peroxidase extracelular secretada foi produzida por Streptomyces viridosporus T7A.

A peroxidase catalisa uma ampla gama de substratos usando peróxido de hidrogênio ou outros peróxidos. Esta enzima é usada na indústria de alimentos para produzir sabor, cor e textura e melhorar a qualidade nutricional dos alimentos. Outras aplicações incluem seu uso como biossensores, na síntese de polímeros e no gerenciamento de poluentes no meio ambiente. Pode ser usada no tratamento de efluentes fenólicos de indústrias. A inativação térmica de peroxidases é usada na indústria de alimentos para medir a eficiência do tratamento de branqueamento, o que aumenta ainda mais a vida útil dos alimentos. O efeito negativo das peroxidases é que causam escurecimento indesejável em frutas e sabores estranhos em vegetais.

α-acetolactato descarboxilase. Esta enzima pode ser produzida a partir de microrganismos naturais, como Brevibacillus brevis ou de Saccharomyces cerevisiae recombinante. A enzima converte cataliticamente o acetolactato em acetoína por meio de uma reação de duas etapas, envolvendo a descarboxilação direta do substrato em um derivado de enol e sua protonação adicional no produto final.

A remoção baseada em enzimas de α-acetolactato e α-aceto-α-hidroxibutirato auxilia na superação da etapa limitante da taxa de maturação da cerveja. Enquanto a maturação da cerveja sem o uso de enzimas leva de duas a 12 semanas, o uso da α-acetolactato descarboxilase resulta em maturação em 24 horas, dependendo da fonte da enzima. Além disso, o gosto estranho devido a presença de diacetil na cerveja é anulado pela ação dessa enzima. Estudos indicam que tanto a forma livre quanto a encapsulada dessa enzima atuam de forma eficiente no processo, auxiliando no uso de enzimas imobilizadas a custos reduzidos. Novas nanoflores inorgânicas ou microesferas de alginato imobilizadas com α-acetolactato descarboxilase são estratégias promissoras com melhor estabilidade térmica, reutilização e eficiência catalítica.

Asparginase. Das várias enzimas derivadas de microrganismos, as asparaginases formam uma classe importante de enzimas nutracêuticas e industrialmente significativas, amplamente utilizadas pelo homem.

A asparaginase, como o nome indica, catalisa a degradação da asparagina em ácido aspártico derivado de ácido subsequente e NH3 e pode ser considerada como a enzima depletora de asparagina, um aminoácido não essencial para os humanos, ao passo que é um aminoácido essencial para as células cancerosas. Assim, a depleção da asparagina afeta criticamente o crescimento das células cancerosas, que constituem a base dessa enzima como agente anticâncer.

Vários métodos de processamento de alimentos, como fritar em óleo e assar, causam a conversão da asparagina em acrilamida, um conhecido agente cancerígeno. Entre os vários métodos que tentam superar a formação de acrilamida, o esgotamento das asparaginas por tratamento enzimático foi considerado eficaz na redução da formação de acrilamidas a partir das asparaginas em 97%.

Aplicação no processamento de alimentos

As enzimas microbianas são usadas em diversos produtos e processos alimentícios, sendo a maioria das enzimas industriais utilizadas atualmente de ação hidrolítica, aplicadas para a degradação de várias substâncias naturais. As proteases continuam a ser o tipo de enzima dominante, devido ao seu extensivo uso na indústria de laticínios. Várias carboidrases, principalmente amilases e celulases, usadas nas indústrias de amido e de panificação, representam o segundo maior grupo.

Os produtos lácteos representam uma área ampla na indústria de alimentos, que produz uma grande variedade de produtos, como leite, queijo, manteiga, sorvete e iogurte, e onde a principal função das enzimas microbianas é melhorar o processo ou característica dos produtos finais, tais como sabor, cor, consistência, composição, aparência e estrutura.

Um dos principais focos da indústria de laticínios é o desenvolvimento de produtos sem lactose. Os produtos isentos ou com baixa lactose permite que pessoas intolerantes consumam leite fermentado com baixo teor de lactose, sorvetes e bebidas lácteas. A lactose é removida por hidrólise parcial pela β-amilase ou hidrólise completa pela lactase. A enzima lactase hidrolisa a ligação glicosídica, resultando na união do hidrogênio no oxigênio e do carbono OH- ao livre, obtendo glicose e galactose.

Entre outras enzimas, as proteases ácidas, como a quimosina, são empregadas como coagulantes na fabricação de queijos. A quimosina representa cerca de 20% a 30% dos coagulantes do leite usados em todo o mundo. As proteinasesfavorecem o amadurecimento do queijo, acelerando a hidrólise de proteínas, que é o evento bioquímico mais importante nesse estágio e tem alto impacto na textura e no sabor. Adicionalmente, as peptidases são usadas para remover o amargor produzido pelas proteinases durante o amadurecimento. As transglutaminases ajudam na ligação cruzada de ligações peptídicas e aumentam as propriedades funcionais dos produtos lácteos. As lipases são utilizadas para o desenvolvimento de sabores característicos. Estas enzimas hidrolisam os ácidos graxos de cadeia curta, diminuindo a formação de ácidos graxos trans e obtendo cerca de 15 a 30 vezes mais sabor do que o processo tradicional.

Os tipos de queijo dependem do processo de maturação, o que confere textura e aroma característicos. No amadurecimento, as lipases desempenham papel importante na hidrólise de triglicérides, diglicerídeos, monoglicerídeos, ácidos graxos e glicerol para ácidos graxos livres, responsáveis pelo desenvolvimento característico do sabor. O processo de amadurecimento com lipases é cerca de duas a cinco vezes mais rápido. No entanto, é importante otimizar a quantidade de enzima adicionada e sua atividade enzimática, pois altos níveis de lipase podem levar a rancidez e redução no rendimento.

Os produtos cárneos são uma importante fonte de proteínas alimentares e também de minerais e vitaminas. A melhora das características organolépticas é um enorme desafio para a indústria da carne. O amaciamento da carne pelo uso de enzimas proteolíticas ajuda a evitar o uso de produtos químicos e salmouras. Embora a transglutaminase seja amplamente utilizada, a papaína e a ficina também encontram aplicação nessa área. Esta enzima também é usada no processamento de alimentos para aumentar o valor nutricional, pois pode adicionar aminoácidos essenciais em matrizes de proteínas. Além disso, ajuda na ligação de pequenos pedaços de carne criando peças maiores; melhora a textura, a firmeza e a elasticidade; emulsifica e homogeneiza os produtos cárneos, como as salsichas, levando a uma maior qualidade e a mais variedades. Também permitem o uso de matérias-primas de baixa qualidade, como o colágeno, aumentando seu valor nutricional ao suplementar com aminoácidos deficientes. Juntamente com as proteases, a termolisina é utilizada para produzir proteína alimentar e acelerar o amadurecimento de salsichas secas.

As principais características dos produtos de panificação são suavidade, frescor e cobertura crocante no pão. Além de compensar as variações na farinha, as enzimas microbianas são importantes para melhorar o sabor e contribuem para mais de um quarto do mercado mundial de panificação. As lipoxigenases embranquecem a farinha e fornecem propriedades viscoelásticas à massa, enquanto a α-amilase, a lacase, a xilanase, a proteasee as lipases aumentam a elasticidade e qualidade da massa, através da formação de uma estrutura homogênea e fina. Além disso, proporciona cor, miolo, maciez, frescura, prazo de validade, maior volume e menor sabor aos produtos finais.

A reação de Maillard pode gerar descoloração durante o cozimento, mas o uso de glicose oxidase previne essas mudanças desfavoráveis e ainda reduz o tempo de fermentação. Açúcares juntamente com asparagina contida na farinha produzem acrilamida através da reação de Maillard. A asparaginase inibe a formação de acrilamida durante o cozimento pela hidrólise da asparagina livre em ácido aspártico, o que não favorece a reação de Maillard. A concentração de acrilamida diminuiu em 95% sem afetar as características sensoriais dos produtos finais.

Por outro lado, as fitases são utilizadas para aumentar o volume e melhorar a textura do pão. Além disso, reduzem o conteúdo de fitatos nos pães, bem como o tempo de fermentação da massa sem afetar o pH, a viscosidade e a mastigabilidade. As proteases de sulfidrilatambém melhoram a elasticidade e a firmeza da massa, bem como as propriedades viscoelásticas, a retenção de gás e as propriedades termofixas dos produtos de panificação. As transglutaminases também aumentam a elasticidade e o volume (aumento de 14% em relação aos métodos tradicionais). A transglutaminase é usada em conjunto com a lacase para a obtenção de pães sem glúten. Enfim, o uso de enzimas melhora significativamente o prazo de validade e reduz o endurecimento do pão.

Em bebidas fermentadas, como o vinho e a cerveja, as principais preocupações são a otimização do processo, a melhoria do rendimento e a manutenção ou aprimoramento de cor e sabor. As enzimas contribuem com esses fatores e também reduzem as calorias da cerveja e os níveis de enxofre, além de melhorarem a clareza do vinho. Especificamente, as proteases sulfidrilas aumentam a clareza; e o acetolactato descarboxilase remove o odor da manteiga na cerveja, causada pela presença de diacetil como produto de fermentação. As β-glucanases são utilizadas para reduzir a viscosidade da cerveja; e as pectinases desempenham papel importante no vinho e na cerveja, facilitando as etapas de extração e filtração, melhorando o rendimento do suco, o sabor, o odor e o processo de clarificação. Embora as pectinases com baixa atividade estejam naturalmente presentes nos sucos de frutas e vegetais, as enzimas microbianas são utilizadas, principalmente, devido a sua estabilidade e resistência as condições de fermentação.

No caso de bebidas aromatizadas, como suco de frutas e verduras, os pontos cruciais de fabricação estão relacionados à estabilidade, qualidade, clarificação, viscosidade e rendimento durante a elaboração, qualidade críticas para a aceitação do consumidor.

O primeiro passo na elaboração do suco é a maceração de frutas e vegetais e as enzimas empregadas nesse processo são as pectinases, as celulases e as hemicelulases, também conhecidas como enzimas de maceração, as quais catalisam a degradação de heteropolissacarídeos, como celulose e pectina, em açúcares simples e, assim, aumentam o rendimento. Além do seu uso na extração de suco, as celulases aumentam a estabilidade e a textura, diminuindo a viscosidade em néctares e purês. Já as pectinases ajudam a manter a estabilidade da mistura, diminuindo a viscosidade e a turbidez de néctares e polpas. As lacases são amplamente empregadas na produção de sucos para diminuir o sabor proveniente de compostos fenólicos e para aumentar a estabilização das bebidas. As peroxidasestambém são empregadas para eliminar cores e sabores indesejados. As transglutaminases ajudam a manter a vida útil e a frescura por mais tempo, facilitando o desenvolvimento de filmes proteicos que atua como uma barreira em frutas e legumes. Outra enzima importante é a naringinase, que remove o amargor do suco cítrico, além de possuir propriedades antioxidantes e manter a estabilidade e as características organolépticas do produto.

Atualmente, o valor nutricional dos produtos alimentícios é uma característica muito importante para os consumidores. Enzimas como a α-galactosidase e as fitases são usadas como melhoradores alimentícios, especialmente em produtos originários de leguminosas e cereais.

O fitato é bem conhecido por seu caráter antinutriente por meio de quelação de cátions bivalentes e multivalentes e por sua ligação com proteínas carregadas positivamente e, com isso, reduz a biodisponibilidade desses nutrientes. A fitase ajuda na desfosforilação eficiente do fitato, liberando minerais e, assim, aumentando sua biodisponibilidade e nutrição.

Os adoçantes representam uma grande área de oportunidade para as enzimas; amilases e glucoamilasescatalisam a hidrólise do amido com uma taxa de conversão de cerca de 95%. As invertases auxiliam na redução da intensidade de doçura e a termolisina é empregada na produção de aspartame.

Os alimentos hipoalergênicos oferecem outra área potencial de desenvolvimento de mercado. Alimentos como trigo, amendoim, soja, grão de bico, leite e ovos possuem proteínas antigênicas que podem causar reações alérgicas. As enzimas mais específicas e eficientes, como as proteases, actinase, alcalase e neutrase ajudam a reduzir os alérgenos, proporcionando benefícios para a saúde.

Outra aplicação das enzimas na indústria de alimentos está no monitoramento dos parâmetros de qualidade de processos. O uso de enzimas como biossensores ajuda na monitoração e detecção dos compostos alvo, combinando fortemente elementos de reconhecimento biológico e transdutores físicos. O primeiro biossensor foi desenvolvido em 1962, mas somente em 1967 foi relatado o primeiro biossensor enzimático baseado em glicose oxidase, usado para monitorar a fermentação de vinho e cerveja. Existem outros biossensores enzimáticos destinados a determinação de frutose, lactose, ácido lático, ácido málico e ácido acético.

Os nutracêuticos, substâncias ou parte de alimentos que proporcionam benefícios à saúde, ganharam importância mundial. A potencial aplicação de diferentes enzimas para a produção de nutracêuticos é um vasto campo de exploração. O xilooligossacarídeo é um nutracêutico produzido da biomassa lignocelulósica, usado como adoçante artificial. A xilanase é empregada para extrair xilana (hemicelulose) e obter xilooligossacarídeo. A β-galactosidase é usada para hidrolisar a lactose a fim de obter oligossacarídeos de leite, que são benéficos para melhorar o sistema de defesa em bebês.

As enzimas também podem contribuir para manter a segurança e o prazo de validade dos alimentos, controlando as populações microbianas. A lisozima, por exemplo, é um agente antimicrobiano natural empregado em alimentos, uma vez que previne o crescimento de bactérias gram-positivas em queijos e aumenta o controle de deterioração em vinhos, cervejas, carnes etc., Além de prolongar a vida útil. O uso de enzimas, como a glicose oxidase, como antioxidante também ajuda a aumentar o prazo de validade dos alimentos. Podem ser usadas para remover oxigênio e espécies reativas de oxigênio, reduzindo, assim, os hidroperóxidos lipídicos. Outra enzima envolvida na conservação de alimentos é a transglutaminase, eficiente na conservação de carnes e na prevenção da sua contaminação.